上一期我們給大家講解了免疫熒光技術(shù)的樣品制備流程和注意事項(xiàng)，這一期我們一起來(lái)學(xué)習(xí)一下免疫熒光技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作流程和技術(shù)細(xì)節(jié)。
下面，我們首先來(lái)看一下免疫熒光技術(shù)的操作流程：
免疫熒光技術(shù)流程
細(xì)胞間接免疫熒光-IF(ICC)
按合適的細(xì)胞密度接種細(xì)胞爬片
1.棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗3次，5 min/次。
2.固定：4%多聚甲醛室溫固定20 min，也可4℃固定過(guò)夜。
根據(jù)細(xì)胞室提供細(xì)胞的時(shí)間，若下午提供，那么當(dāng)天不能完成實(shí)驗(yàn)，所以會(huì)在固定這步暫停，即4℃固定過(guò)夜；若上午提供細(xì)胞，當(dāng)天可以完成全部實(shí)驗(yàn)，即室溫固定20min。平時(shí)多數(shù)實(shí)驗(yàn)是室溫固定20min。
3.PBS洗3次，5 min/次。
4.透膜：用含有0.3% Triton X -100的 PBS室溫孵育20 min（如檢測(cè)細(xì)胞膜外側(cè)蛋白，可省略此步）。
5.PBS洗3次，5 min/次。
6.封閉：用PBS配制的5%~10%二抗來(lái)源相同種屬正常血清室溫封閉20 min。
7.PBS洗3次，3 min/次。
8.用Bioss標(biāo)準(zhǔn)抗體稀釋液按合適比例稀釋一抗，37℃下孵育2 h或4℃過(guò)夜（孵育抗體的濃度、孵育時(shí)間通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。
9.PBST洗3次，10 min/次。
10.用Bioss標(biāo)準(zhǔn)熒光抗體稀釋液按合適比例稀釋二抗，37℃下孵育1h （孵育抗體的濃度、孵育時(shí)間通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定） 。
11.PBST洗3次，10 min/次。
12.DAPI復(fù)染細(xì)胞核。
13.PBS洗3次，5 min/次。
14.取出細(xì)胞爬片置于載玻片上，鏡下觀察。
冷凍組織切片間接免疫熒光（IF-F）
1.制備好的冰凍切片放置于室溫復(fù)溫。
2.PBS洗3次，5 min/次。
3.封閉：用PBS配制的5%~10%二抗來(lái)源相同種屬正常血清室溫封閉20 min。
4.PBS洗3次，3 min/次。
5.用Bioss標(biāo)準(zhǔn)抗體稀釋液按合適比例稀釋一抗，37℃下孵育2 h或4℃過(guò)夜（孵育抗體的濃度、孵育時(shí)間通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。
6.PBST洗3次，10 min/次。
7.用Bioss標(biāo)準(zhǔn)熒光抗體稀釋液按合適比例稀釋二抗，37℃下孵育1h （孵育抗體的濃度、孵育時(shí)間通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定） 。
8.PBST洗3次，10 min/次。
9.DAPI復(fù)染細(xì)胞核。
10.PBS洗3次，5 min/次。
11.用防熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察。
石蠟包埋組織切片間接免疫熒光（ IF-P ）
1.制備好的石蠟切片按以下順序進(jìn)行脫臘水化
二甲苯?：20min，二甲苯П：20min，二甲苯Ш：20min，無(wú)水乙醇：15min，95%乙醇：15min，70%乙醇：15min，50%乙醇：15min，蒸餾水?：5min，蒸餾水II：10min。
2.PBS洗3次，5 min/次。
3.抗原修復(fù)：0.01M枸櫞酸修復(fù)液（依據(jù)抗原種類不同選擇合適的抗原修復(fù)液與修復(fù)方式），沸水浴熱修復(fù)15min。
4.PBS洗3次，5 min/次。
5.封閉：用PBS配制的5%~10%二抗來(lái)源相同種屬正常血清室溫封閉20 min。
6.PBS洗3次，3 min/次。
7.用Bioss標(biāo)準(zhǔn)抗體稀釋液按合適比例稀釋一抗，37℃下孵育2 h或4℃過(guò)夜（孵育抗體的濃度、孵育時(shí)間通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。
8.PBST洗3次，10 min/次。
9.用Bioss標(biāo)準(zhǔn)熒光抗體稀釋液按合適比例稀釋二抗，37℃下孵育1h （孵育抗體的濃度、孵育時(shí)間通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定） 。
10.PBST洗3次，10 min/次。
11.DAPI復(fù)染細(xì)胞核。
12.PBS洗3次，5 min/次。
13.用防熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察。
直接免疫熒光
1. 4%多聚甲醛室溫固定樣品20 min，也可4℃固定過(guò)夜。
2.PBS洗3次，5 min/次。
3.封閉：用PBS配制的5%~10%二抗來(lái)源相同種屬正常血清室溫封閉20 min。
4.PBS洗3次，3 min/次。
5.用Bioss標(biāo)準(zhǔn)熒光抗體稀釋液按合適比例稀釋一抗，37℃下孵育2h或4℃過(guò)夜（孵育抗體的濃度、孵育時(shí)間通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。
6.PBST洗3次，10 min/次。
7.DAPI復(fù)染細(xì)胞核。
8.PBS洗3次，5 min/次。
9.用防熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察。
1.通透
通透能夠使抗體與胞內(nèi)抗原相結(jié)合，其中包括抗原表位位于胞內(nèi)端的跨膜蛋白，使用溶劑或去垢劑可實(shí)現(xiàn)通透化。若采用丙酮或甲醇固定，則可跳過(guò)。
1.溶劑：可在用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后使用。推薦用于細(xì)胞骨架、病毒和某些酶抗原。
2.去垢劑：包括能夠破壞蛋白的作用劇烈的去垢劑（如 Triton X-100 或 Np-40）；也可以是不會(huì)溶解質(zhì)膜的作用溫和的去垢劑（如 Tween 20、皂素或洋地黃皂苷）。
2.封閉
用血清或蛋白封閉劑進(jìn)行封閉是避免抗體與組織（某些易結(jié)合蛋白的物質(zhì)）或 Fc 受體（結(jié)合抗體恒定區(qū) (Fc) 的受體）非特異性結(jié)合的必要手段。理論上，對(duì)靶標(biāo)表位沒(méi)有親和性結(jié)合的任何蛋白都可用于封閉。但事實(shí)上，某些蛋白更容易與非特異性位點(diǎn)相結(jié)合，因此他們更適合用于封閉。血清中包含可與非特異位點(diǎn)結(jié)合的抗體，是一種常用的封閉劑。推薦使用與二抗相同宿主的血清。當(dāng)使用來(lái)自不同物種的二抗進(jìn)行多重染色時(shí)，需要使用這些物種的血清共同封閉。
自發(fā)熒光的封閉
自發(fā)熒光可由組織中存在的熒光化合物引起，例如黃素和卟啉。這些化合物會(huì)被用于固定、脫水切片的溶劑從組織中溶解，然而，其仍會(huì)存留在使用水性試劑處理的冰凍切片中；固定步驟也可能誘導(dǎo)自發(fā)熒光，在使用醛類固定劑時(shí)通常會(huì)發(fā)生這類情況，醛類固定劑會(huì)與胺類反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物。應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)以確保待研究的組織沒(méi)有內(nèi)在自發(fā)熒光或者固定步驟不會(huì)誘導(dǎo)自發(fā)熒光。
1.使用冰凍切片，降低固定過(guò)程中誘導(dǎo)自發(fā)熒光的可能性。
2.使用非醛類的固定劑。
3.用硼氫化鈉或甘氨酸/賴氨酸處理組織，以此封閉固定過(guò)程中帶來(lái)的醛基。
4.利用淬滅染料處理組織，例如滂胺天藍(lán)/蘇丹黑/臺(tái)盼藍(lán)或FITC封閉劑。
3.抗體染色
1. 一抗孵育溫度可以選擇4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳（ 4℃和37℃時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色）。
2. 孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃ 下1~2h，4℃下孵育過(guò)夜，注意4℃孵育后需要復(fù)溫（防止切片從4℃直接放入PBS易脫片）。
3. 二抗一般室溫或37℃ 30min~2h，具體時(shí)間需要摸索。
檢測(cè)結(jié)果展示
